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解析棘蛋白结构──新冠病毒变异株如何增强传染力,巧妙躲避免疫系统?

2025-04-07 241


为何新冠病毒突变之后传染力更强?COVID-19 至今仍深深影响全人类,新冠病毒持续演化,例如曾经造成台湾大规模社区感染的 Alpha 变异株、传染力更强的 Delta 变异株,近期出现的 Omicron 变异株等,它们逃避免疫系统的能力都不一样,关键就在不同的棘蛋白(spike protein)结构。“研之有物”专访中央研究院生物化学研究所徐尚德副研究员,他的团队陆续解析各种新冠病毒变异株的棘蛋白结构,不但能厘清新的突变带来的威胁,后续也可做为研发人造抗体的指引。

解析新型冠状病毒棘蛋白

COVID-19 的病原体是一种冠状病毒,和 SARS 病毒是近亲,正式命名为 SARS-CoV-2,中文常称做新型冠状病毒。为了知道病毒如何感染人体细胞,以及如何逃避免疫系统的辨识,我们需要进一步了解冠状病毒表面的棘蛋白结构。

结构为什么重要?因为结构会影响蛋白质功能。蛋白质是由不同的氨基酸所组成的长炼,实际作用时会折叠形成特别立体结构,而冠状病毒的蛋白质中,又以棘蛋白最为关键。

徐尚德强调,棘蛋白是冠状病毒暴露在表面的蛋白质之一,绝大多数被感染者的免疫系统所产生的抗体都是辨识棘蛋白。因此现今临床使用的蛋白质次单元疫苗、腺病毒疫苗以及 mRNA 疫苗,都是以棘蛋白为基础来研发。

▲ 徐尚德手上拿着新冠病毒的棘蛋白模型,显示棘蛋白与两种不同抗体结合的情况。

Cryo-EM 让蛋白质结构无所遁形

工欲善其事,必先利其器。解析蛋白质结构的方法很多,早期的 X 光晶体绕射(X-ray diffraction),就像将影片定格截图,但不一定为蛋白质实际作用的状态。

再来是核磁共振(Nuclear Magnetic Resonanc,简称 NMR),这是徐尚德留学深造时的专业,可以重现蛋白质在水溶液中的结构及动态,更接近实际作用的形态,可惜不适合分子量较大的分子。

目前结构生物学最具潜力的新技术是:冷冻电子显微镜(Cryogenic Electron Microscopy,简称 Cryo-EM),Cryo-EM 可以拍出原子尺度下高分辨率的三维结构,此技术于 2017 年获得诺贝尔化学奖。中研院则于 2018 年开始添购 Cryo-EM 设备,而 Cryo-EM 正是徐尚德用来解析棘蛋白结构的主要利器!

在 COVID-19 疫情爆发初期(2020年1月),徐尚德就率先启动新冠病毒的结构分析,当时他的研究团队刚好已分析过感染猫科动物的冠状病毒,对于解析棘蛋白结构有一定经验,可说是赢得先机。

具体来说,如何用 Cryo-EM 解析新冠病毒的棘蛋白结构?

首先要大量培养新冠病毒、再分离、纯化得到棘蛋白。接下来,将大量蛋白质样本铺成薄薄一层液体,之后以 -190℃ 急速冷冻,让蛋白质分子保持冻结前的形态,最后用程式重建棘蛋白的三维影像。徐尚德譬喻,就像一匹马在高速移动时,连续拍摄许多照片,再将照片叠加起来,重建马的形状。

棘蛋白的体积已经算大,假如又与其他蛋白质结合,体积将会更大。能解析如此庞大结构为 Cryo-EM 一大优点,但是也会创造很大的资料量。徐尚德强调,用 Cryo-EM 分析蛋白质结构不只做实验,也要协调资料处理等疑难杂症。

▲ 冷冻电子显微镜可以记录同一时间下、不同状态的蛋白质三维立体结构。

关键 D614G 突变,让新冠病毒棘蛋白稳定性大增

尽管已有猫冠状病毒的经验,徐尚德研究团队初期仍经历一阵摸索,一大困难在于,做实验时发现不少棘蛋白坏掉,不再保持原本的结构。

这是因为一般取得蛋白质样本后会置于 4°C 冷藏,但 4°C 其实不适合保存棘蛋白。接着徐尚德细心观察到,具备 D614G 突变的棘蛋白,保存期限竟然比没突变的棘蛋白要长,可以从 1 天增加到至少 1 周。

什么是 D614G 突变呢?武汉爆发 COVID-19 疫情的初版新冠病毒,其棘蛋白全长超过 1200 个氨基酸,D614G 突变的意思就是:第 614 号氨基酸由天门冬胺酸(aspartic acid,缩写为 D)变成甘胺酸(glycine,缩写为 G)。

D614G 突变诞生后,存在感持续上升,2020 年 6 月时已经成为全世界的主流,随后新冠病毒 Alpha、Delta 等变异株,皆建立于 D614G 的基础上。

尽管序列仅有微小差异,许多证据指出 D614G 突变会增加新冠病毒的传染力。有趣的是,它也能大幅增加棘蛋白在体外的稳定性。因此在研究用途上,变种病毒的棘蛋白反而容易保存,徐尚德更指出,对抗变种病毒的蛋白质次单元疫苗(subunit vaccine)稳定性也会增加。

▲ 徐尚德实验室提供的新冠病毒模型与三种不同的棘蛋白模型,棘蛋白的主体为白色,棘蛋白的受器结合区域(receptor binding domain,RBD)为蓝绿色。

新冠病毒棘蛋白的“三只爪子”:受器结合区域

徐尚德参与的一系列新冠病毒结构研究,除了棘蛋白本身,还包含棘蛋白与细胞受器 ACE2 的结合、棘蛋白和人造抗体的结合。

既然要解析结构,仪器“分辨率”能看清楚多小的尺度就很重要!蛋白质结构学的常见单位是 Å(10-10 米),原子与原子间的距离约为 2 Å,Cryo-EM 的极限将近 1 Å,不过棘蛋白大约到 3 Å 便足以重建立体结构。

冠状病毒如何感染宿主细胞,和结构又有什么关系?棘蛋白位于冠状病毒的表面,直接接触宿主细胞受器 ACE2 的部分,称为受器结合区域(receptor binding domain,简称 RBD),结构可能展现“向上”(RBD-up)或是“向下”(RBD-down)的状态。向下,RBD 便不会接触宿主细胞的受器,缺乏感染能力;向上,RBD 方能结合受器,引发后续入侵。

▲ 徐尚德团队透过冷冻电子显微镜,拍摄新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白结构,其中有三类棘蛋白的 RBD 为 1 个向上(占 73%),有一类(类别3)的棘蛋白 RBD 则是 2 个向上(占 27%)。(Source:Nature Structural & Molecular Biology)

新冠病毒表面的棘蛋白有“三只爪子”(3 RBD),RBD 有可能同时向上(3 RBD-up),也可能只有 1~2 个向上,结构会影响病毒的感染能力。更详细地说,棘蛋白某些氨基酸位置的差异,会影响结构的开放与封闭程度。

棘蛋白向上或向下是动态的,假如能保持稳定性,延长向上的时间,也有助于新冠病毒的感染。这正是徐尚德一系列研究下来,实际观察到不同品系的变化。

▲ 截至 2022 年 01 月 18 日的新冠病毒品系发展历史,其中 Delta 变异株拥有最多品系,而 Omicron 变异株则开始兴起。虽然 Omicron 的品系并不多,但已逐渐成为主流。(Source:Nextstrain;GISAID

一网打尽所有高关注变异株的结构变化

和武汉最初的新冠病毒相比,D614G 突变带来什么改变呢?简单说:棘蛋白向上的比例增加了,导致整个结构变得更加开放,增加新冠病毒对宿主受器的亲合力(affinity)。

以 D614G 为基础,接下来又独立衍生出数款品系,皆具备多个突变,传染力、抵抗力更强 。影响最大的是首先于英国现身的 Alpha(B.1.1.7)、南非的 Beta(B.1.351)、巴西的 Gamma(P.1),以及更晚几个月后,于印度诞生的 Kappa(B.167.1)与 Delta(B.167.2)。Alpha 一度于世界广传,导致包括台湾在内的严重疫情,不过随后不敌优势更大的 Delta。

对于上述品系,徐尚德率队一网打尽。 Alpha 的棘蛋白结构解析已经发表于 《自然-结构与分子生物学》(Nature Structural & Molecular Biology)期刊,其余新冠病毒变异株的论文仍在等待审查,目前能在预印网站 bioRxiv 看到,该研究一次报告 38 个 Cryo-EM 结构,刷新纪录。

▲ 图 a 显示新冠病毒 Alpha 变异株棘蛋白的突变氨基酸序列,一共有 9 处突变, D614G 突变以紫色表示。图 b 显示突变的氨基酸在立体结构中的位置。(Source:Nature Structural & Molecular Biology)

Alpha 变异株的 RBD 向上结构稳定

一度入侵台湾造成社区大规模感染的 Alpha 株有何优势?其棘蛋白除了 D614G,还多出 8 处氨基酸突变,徐尚德发现 N501Y(天门冬酰胺变成酪氨酸)、A570D(丙胺酸变成天门冬胺酸)的影响相当关键。

直觉地想,棘蛋白的外层结构才会与受器接触影响传染力,立体结构中第 570 号氨基酸的位置比较里面,乍看并不要紧。但是徐尚德敏锐地捕捉到,A570D 突变会改变局部的空间关系,令“RBD 向上”的结构更加稳定。徐尚德形容为“脚踏板”(pedal-bin)──A570D 突变的效果就像踩着垃圾桶的脚踏板,让桶盖(也就是 RBD)稳定保持开启。

事实上,棘蛋白总体向上的比例,Alpha 还比单纯的 D614G 突变株更少,不过 A570D 增进的稳定性似乎优势更大。研究团队制作缺乏 A570D 突变的人造模拟病毒,尝试体外感染人类细胞,发现感染力明显减少,证实 A570D 突变颇有贡献。

▲ 新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的“A570D 突变”,会改变棘蛋白内部的空间,让“RBD 向上”的结构更加稳定,就像踩着垃圾桶的脚踏板,让桶盖保持开启。(Source:徐尚德、Nature Structural & Molecular Biology)

Alpha 变异株的棘蛋白亲近宿主细胞,干扰抗体作用

另一个重要突变是 N501Y,不只 Alpha 有,Beta 等许多品系也有,Delta 则无。N501Y 在众多品系独立诞生,似乎为趋同演化所致。N501Y 能为病毒带来哪些优势?

第 501 号氨基酸位于棘蛋白表面,会直接与宿主受器 ACE2 结合。此一位置变成酪氨酸(tyrosine,缩写为 Y)后,和受器的 Y41 两个酪氨酸之间,容易形成苯环和苯环的“π–π stacking”键结,从而大幅提升棘蛋白对细胞的亲合力。

▲ 新冠病毒 Alpha 株棘蛋白的“N501Y 突变”,让 RBD 的氨基酸与宿主细胞受器 ACE2 形成“π–π stacking”键结,大幅提升棘蛋白对宿主细胞的亲合力。(Source:Nature Structural & Molecular Biology)

另一方面,N501Y 突变也会干扰抗体的作用。中研院细胞与个体生物学研究所的吴汉忠特聘研究员,率队研发一批针对棘蛋白的人造抗体,测试发现有一款抗体 chAb25 对 D614G 突变株相当有效,但是对 Alpha 株无能为力。徐尚德由结构分析发现:N501Y 改变了棘蛋白表面的形状,让抗体 chAb25 无法附着。

好消息是,另外有两款抗体 chAb15、chAb45,依然能有效对抗 Alpha 病毒,不受 N501Y 影响。这两款抗体会附着在棘蛋白 RBD 的边缘,避免棘蛋白和宿主细胞接触。而且抗体 chAb15、chAb45 会各占一方,可以同时使用,多面协同打击病毒。

▲ 虽然新冠病毒 Alpha 株的棘蛋白表面让某些抗体难以附着,还好仍有两款抗体 chAb15(绿色)、chAb45(黄色)能有效“卡住”棘蛋白,干扰棘蛋白与宿主细胞结合。抗体 chAb15、chAb45 附着的位置,正好就是棘蛋白与宿主细胞结合的地方。(Source:Nature Structural & Molecular Biology)

棘蛋白结构不只氨基酸,还要注意表面的糖

有了 Alpha 的经验,接下来分析 Beta、Gamma、Kappa、Delta 便顺手很多。这批新冠病毒的棘蛋白变化多端,但是“RBD 向上”的整体比例皆超过 Alpha 和 D614G 突变株,可见适应上各有巧妙。徐尚德也发现,要厘清棘蛋白的结构,不能只关心蛋白质,还要考虑棘蛋白表面的糖基化(glycosylation)修饰。

蛋白质在完工后,某些氨基酸还能加上各种糖基。病毒蛋白质表面的糖基可以做为防护罩,干扰抗体和免疫系统的辨识。糖基化修饰就像替病毒订做一套迷彩外衣,不同变异株的情况都不一样,假如糖基化的位置和数量,由于突变而改变,便有可能影响立体结构,有助于它们闪躲抗体。例如和武汉原版新冠病毒相比,Delta 株棘蛋白少了一个糖化修饰,Gamma 株棘蛋白则多了两处糖化。

还好从结构看来,并没有任何突变组合能完美逃避抗体。例如由美国的雷杰纳荣制药公司(Regeneron)制作并通过紧急使用授权的抗体;以及中研院吴汉忠率队研发,有望投入实用的多款人造抗体,对变异品系依然有效。这场人类与病毒的长期抗战中,同时使用多款抗体的“鸡尾酒”疗法,仍然是可行的医疗方案。

回顾将近两年来的研究之路,徐尚德表示:时间压力真的非常大!COVID-19 疫情爆发后,全世界投入相关研究的专家众多,只要稍有迟疑,便会落在竞争者后头。但是即使跑在最前端的研究者,也只能苦苦追赶病毒演化的速度,一篇论文还在审查时,现实世界的疫情已经迈向全新局面。

人类要赢得胜利,必需全方面认识病毒,而结构无疑是相当重要的一环。

(作者:寒波;本文由 研之有物 授权转载;首图来源:pixabay)

2022-02-05 02:57:00

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